光片熒光顯微鏡（Light Sheet Fluorescence Microscopy, LSFM）的概念產(chǎn)生于1903年，但此后很長時間并無太多發(fā)展。上世紀九十年代，華盛頓大學的Francis Spelman實驗室為了對小鼠毛細胞的結構和耳蝸的其他特性進行定量測量，發(fā)展了一系列實驗方法。實驗室研究人員受到前人使用側向光片照明觀察表面結構的啟發(fā)，發(fā)明了正交平面熒光光學切片裝置（orthogonal plane fluorescence optical sectioning, OPFOS），并**次獲得了整個耳蝸的清晰熒光圖像(1) (2) (3)。2004年，SPIM（Single plane illumination microscopy ）文章的發(fā)表大大促進了光片顯微鏡的發(fā)展和使用(4)，文章強調(diào)了其用于胚胎發(fā)育研究的實用性，并給出了青鳉神經(jīng)節(jié)細胞搏動以及果蠅胚胎發(fā)育長時間成像的熒光圖像。 2010年，在**屆光片熒光顯微鏡研討會上，研究者們決定將LSFM作為這一類顯微鏡的統(tǒng)一名稱(5)。后續(xù)又出現(xiàn)了很多形式的光片顯微鏡，如掃描光片(6)、雙光子掃描光片(7)和bessel beam(8)、lattice(9)等新式光片顯微鏡。這些方法不斷改善光片顯微鏡的成像分辨率、穿透深度和成像視野，以期滿足生物學發(fā)展的需要。

光片顯微系統(tǒng)成像原理

光片顯微系統(tǒng)使用一層光束從樣品側面激發(fā)熒光樣品，使用CCD或SCMOS進行檢測，照明光路和熒光檢測光路互相垂直。由于樣品受激發(fā)的平面就是成像平面，不存在離焦激發(fā)，可以自動獲得光學切片，從而將光漂白和光學損傷降到*低。光片顯微系統(tǒng)使用CCD或SCMOS成像，速度通常為每秒幾十幀，甚至上百幀，所以通過在光片下移動樣品使入射光束激發(fā)不同的平面，可以很容易又非?？焖俚牡玫秸麄€組織的3D圖傳統(tǒng)共聚焦的激發(fā)和檢測是同一個方向，整個照射區(qū)域都處于被激發(fā)狀態(tài)，沒有被檢測的區(qū)域經(jīng)過長時間的照射易被淬滅，無法保證幾天的記錄；另外共聚焦使用點掃描成像，速度相對較慢。

光片熒光顯微鏡與共聚焦顯微鏡的區(qū)別

2015年，Leica推出了自己的光片系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用獨特的 TwinFlect 反光鏡裝置使激發(fā)光束從左右兩個方向入射到樣品上，照明均勻，保證了細胞水平的分辨率。成像速度快、分辨率高和光毒性低的特點可使樣品在該系統(tǒng)中保持其生物活性，完成數(shù)小時乃至數(shù)天的長時間活體生物培養(yǎng)及成像。另外，Leica光片系統(tǒng)以共聚焦為基礎，可以實現(xiàn)與共聚焦顯微鏡的聯(lián)合使用，完成光激活、光轉(zhuǎn)換等操作及后續(xù)追蹤的實驗。

Leica光片顯微系統(tǒng)常見應用

• 胚胎與小型生物(如模式動物斑馬魚、線蟲、果蠅等，植物擬南芥等)發(fā)育過程中的快速三維成像，例如：細胞遷移、心臟及血管發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育等。

• 三維細胞培養(yǎng)、球體和囊腫、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)的實時成像。

• 結合共聚焦或雙光子激光顯微鏡，完成光學刺激與追蹤的功能，觀察和實驗方式更為靈活多樣。

1. 快速3D成像

斑馬魚血管系統(tǒng)3D重構

2. 活體快速長時間3D成像，捕捉整個動態(tài)過程

高速成像：斑馬魚跳動的心臟

果蠅背部閉合過程

3. **可以結合共聚焦和光片的系統(tǒng)，實現(xiàn)光學操作的后續(xù)追蹤

斑馬魚神經(jīng)元光轉(zhuǎn)換(Kaede)后，持續(xù)記錄該細胞的運動

斑馬魚尾部，光轉(zhuǎn)換(Kaede，405 nm)后細胞去修復被多光子激光造成的損傷部位

使用LAS X 3D分析追蹤光轉(zhuǎn)換的細胞

長時間的圖像采集需要維持樣品的活性，Leica光片系統(tǒng)可加載孵育裝置，為樣品提供良好的生長條件，保持活性。另外整個系統(tǒng)的開放性很高，有更多可操作的空間。

參考文獻

1.Voie AH, Burns DH, Spelman FA.(1993) Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J Microsc. Jun;170(Pt 3):229-36.

2.Voie AH, Spelman FA. (1995) Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections. Comput Med Imaging Graph. Sep-Oct;19(5):377-84.

3.Voie AH. (2002) Imaging the intact guinea pig tympanic bulla by orthogonal-plane fluorescence optical sectioning microscopy. Hear Res. Sep;171(1-2):119-128. Erratum in: Hear Res. 2003 Jul;181(1-2):144.

4.Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., and Stelzer, E. H. (2004) Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science (New York, N.Y 305, 1007-1009

5.Reynaud EG, Tomancak P. (2010) Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. Aug;5(8):798-804. doi: 10.1002/biot.201000177

6.Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., and Stelzer, E. H. (2008) Reconstruction of zeb rafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science (New York, N.Y 322, 1065-1069

7.Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., and Fraser, S. E. (2011) Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature methods 8, 757-760

8.Planchon, T. A., Gao, L., Milkie, D. E., Davidson, M. W., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., and Betzig, E. (2011) Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nature methods 8, 417-423

9.Chen, B. C., Legant, W. R., Wang, K., Shao, L., Milkie, D. E., Davidson, M. W., Janetopoulos, C., Wu, X. S., Hammer, J. A., 3rd, Liu, Z., English, B. P., Mimori-Kiyosue, Y., Romero, D. P., Ritter, A. T., Lippincott-Schwartz, J., Fritz-Laylin, L., Mullins, R. D., Mitchell, D. M., Bembenek, J. N., Reymann, A. C., Bohme, R., Grill, S. W., Wang, J. T., Seydoux, G., Tulu, U. S., Kiehart, D. P., and Betzig, E. (2014) Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science (New York, N.Y 346, 1257998